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RNA提取的操作關(guān)鍵點(diǎn)在哪?

 更新時(shí)間:2023-09-18 點(diǎn)擊量:872

RNA是目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生物功能zui豐富多樣的生物大分子,同時(shí)是DNA與蛋白質(zhì)信息傳遞的橋梁,因此完整RNA的提取和純化是功能基因組時(shí)代的重要手段。那么你知道RNA提取的關(guān)鍵點(diǎn)在哪嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵:①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;②有效地使核蛋白復(fù)合體變性解離,釋放出RNA;③對(duì)RNA酶的有效抑制;④有效地將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離;⑤對(duì)于多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。

RNA酶(RNase),尤其是胰RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類。除細(xì)胞內(nèi)RNase以外,環(huán)境中灰塵、各種試驗(yàn)器皿和試劑、人體的汁液以及唾液中均存在RNase。這類酶耐熱、耐酸、耐堿,如煮沸也不能使之wan全失活,蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時(shí)失活,但變性劑去除后,又可恢復(fù)活性。RNase 的活性不需要輔助因子,二價(jià)金屬離子螯合劑對(duì)它的活性無(wú)任何影響,故在提取RNA時(shí),應(yīng)盡力減少RNA酶對(duì)RNA的降解作用。

創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境主要包括兩個(gè)方面的工作,即極力避免外源RNase的污染和盡力抑制內(nèi)源性RNase的活力。前者主要來(lái)源于操作者的手、實(shí)驗(yàn)的器皿和試劑;后者主要來(lái)源于樣品的組織細(xì)胞。RNA提取應(yīng)在潔凈的環(huán)境中進(jìn)行,戴口罩和手套操作,使用一次性無(wú)菌器具,玻璃器皿用0.1%二乙基焦碳酸鹽(diethyl procarbonate, DEPC) 按規(guī)定消毒,所用試劑也應(yīng)經(jīng)專門(mén)的消毒滅酶處理。內(nèi)源RNA酶則采用加入抑制劑及向提取液中加入可使所有蛋白質(zhì)變性的試劑:如異硫氰酸胍(GTC) 和F巰基乙醇,鹽酸胍,尿素,去污劑(十二烷酰肌氨酸鈉、SDS),酚/氯仿,整個(gè)提取操作都在冰浴下(0~4℃) 操作。

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