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賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號11668019）說明書及操作指南
Lipofectamine 2000是賽默飛世爾研發(fā)的高效陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于哺乳動物細(xì)胞的DNA、siRNA及CRISPR組件遞送。其采用脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)，在保證轉(zhuǎn)染效率的同時顯著降低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、RNA干擾及基因編輯研究。
· 貨號：11668019
· 包裝規(guī)格：0.75 mL / 1.5 mL
· 適配樣本：DNA（質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物）、RNA（siRNA/miRNA/lncRNA）
· 推薦細(xì)胞類型：HEK293、HeLa、CHO、原代細(xì)胞等
· 儲存條件：4℃避光保存（嚴(yán)禁凍存）
· 有效期：未開封12個月，開封后6個月
1. 試劑配制
①稀釋液選擇：Opti-MEM®（貨號31985070）或同類型無血清培養(yǎng)基
②DNA稀釋：每孔2-4 μg DNA，用250 μL稀釋液混勻
③脂質(zhì)體稀釋：按DNA用量1:2.5比例稀釋（如2 μg DNA需5 μL Lipofectamine 2000）
2. 復(fù)合物制備
①將DNA與脂質(zhì)體稀釋液等體積混合
②室溫靜置15-20分鐘，形成乳白色復(fù)合物（顯微鏡下可見均勻納米顆粒）
3. 細(xì)胞處理
①轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度：70%-80%融合
②移除原培養(yǎng)基，加入1 mL含復(fù)合物的新鮮培養(yǎng)基
③37℃培養(yǎng)4-6小時后換液
1. 細(xì)胞狀態(tài)要求
優(yōu)先選用低傳代細(xì)胞（P5-P10），原代細(xì)胞建議預(yù)鋪ECM基質(zhì)（如Matrigel®）
2. 血清干擾機(jī)制
DNA轉(zhuǎn)染可保留≤10%血清，RNA轉(zhuǎn)染需全程無血清（避免核酸酶降解）
3. 毒性控制
①貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染時間≤6小時（超時存活率下降20%-30%）
②懸浮細(xì)胞建議采用分步換液法
1. CRISPR/Cas9基因編輯體系構(gòu)建
質(zhì)粒配比：Cas9質(zhì)粒（1 μg）: sgRNA（1.5 μg）
共轉(zhuǎn)染支持：可同步遞送熒光報告質(zhì)粒（如pmCherry-C1）
效率驗(yàn)證：轉(zhuǎn)染48小時后Western Blot檢測靶蛋白敲除效果（編輯效率≥80%）
2. siRNA沉默實(shí)驗(yàn)優(yōu)化
siRNA工作濃度：20-50 nM
復(fù)合物靜置時間：嚴(yán)格控制在20分鐘內(nèi)（超時導(dǎo)致效率衰減≥15%）
結(jié)果檢測：qPCR驗(yàn)證mRNA水平（建議設(shè)置GAPDH內(nèi)參對照）
| 問題現(xiàn)象 | 可能原因 | 解決方案 |
| 轉(zhuǎn)染效率＜50% | DNA純度不足（OD260/280異常） | 使用酚氯法重新純化DNA |
| 細(xì)胞死亡＞30% | 脂質(zhì)體過量或轉(zhuǎn)染時間過長 | 降低脂質(zhì)體比例至1:1.5，縮短轉(zhuǎn)染至4小時 |
| 熒光信號不均勻 | 復(fù)合物沉淀 | 轉(zhuǎn)染前渦旋混合液10秒 |
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